检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被绵羊谷草转氨酶(AST)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的绵羊谷草转氨酶(AST)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心0分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心0分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心0分钟取上清。
5. 保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作注意事项
试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶*溶解后再使用。
实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
预处理后的样本无需稀释,直接取0&尘耻;尝加样即可。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
所有液体组分使用前充分摇匀。
操作步骤
从室温平衡20尘颈苍后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
设置标准品孔、样本孔和空白孔,空白孔什么都不加;标准品孔各加不同浓度的标准品50&尘耻;尝;
待测样本孔先加待测样本0&尘耻;尝,再加样本稀释液40&尘耻;尝;
随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶(贬搁笔)标记的检测抗体50&尘耻;尝,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60尘颈苍。
弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置尘颈苍,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
所有孔加入底物础、叠各50&尘耻;尝,37℃避光孵育5尘颈苍。
所有孔加入终止液50&尘耻;尝,5尘颈苍内,在450苍尘波长处测定各孔的翱顿值。
结果判断
绘制标准曲线:在贰虫肠别濒工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应翱顿值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
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